使用微叉指阵列电极(IDA)的高灵敏度电化学检测 （介绍连载）
- 第一篇：简介
- 第二篇：微叉指阵列电极的制作
- 第三篇：微叉指阵列电极的特点
- 第四篇：使用IDA电极的高灵敏度伏安法
- 第五篇：自诱导氧化还原循环
- 第六篇：转换溶出法
- 第七篇：应用例1. 氧化态标准样品的测量
- 第八篇：应用例2. 还原态标准样品的测量
- 第九篇：应用例3. 微量样品分析
- 第十篇：应用例4. 多巴胺的高灵敏选择性检测
- 第十一篇：应用例5. 高效液相色谱的检测器
简介
电化学测量常被用来检测微量物质或观察物质的反应行为。
在电化学测量中，当电极面积减少到微米量级时，物质向电极的扩散从线性变为球形，从而使单位时间和单位面积到达电极表面的物质的量增加。 因此，观察到的电流密度增加，并超过了常规测量的极限，这就是为什么微电极会引起人们的关注[1-4]。
因此，利用这些特征可以进行生物传感器[5]、反应中间体的检测和反应过程的分析[6]、高电阻溶液和固体中的电化学反应[7]，以及有机电子器件[8-10]等的研究。
使用这些微电极的电化学测量具有以下特点
1)由于电极的尺寸较小，电流值较小，可使iR降减少。这使得测量高电阻的样品成为可能。
2）双电层的充电电流减少，可以进行高信噪S/N比的快速测量。由
3）由于扩散是各向同性的，电流密度高，可在短时间内达到稳态。
近年来，LSI制造技术的应用不仅可以可靠且高效地制造盘状和线状电极，还可以制造形状复杂的微电极。
因此，人们发现，通过设计电极形状和排列方式，可以获得诸如电流放大和提升选择性等功能。
在这里，我们以一个微小IDA电极为例，剥离金属（lift up），得到一个梳状电极图案（C）。 图案的整个表面被绝缘膜覆盖，在需要被绝缘膜覆盖的区域再次形成光刻胶图案，如引线区（D），对未被抗蚀剂覆盖的绝缘膜进行干蚀，直到电极区暴露出来，得到一个梳状电极（E）。
另一方面，如果整个基底表面首先覆盖一层电极材料的薄膜，然后用蚀刻方法进行加工，即使是在低温下难以制造的材料，如在还原侧具有宽电位窗口的碳薄膜和ITO（透明电极），也可以很容易地加工成微电极[11]。
参考文献
[1] M.Fleischmann, S.Ponds, D.Roison and P.P.Schmidt "Ultramicroelectrodes", Morganton, N.C., 1987.
[2] S.Ponds and M.Flieschmann, Anal. Chem., 59, 1391A (1987).
[3] D.C.Johnson, M.D.Ryan and G.S.Wilson, Anal. Chem., 60, 147R (1988).
[4] 青木幸一、電気化学、56, 608 (1988).
[5] J.Janata and A.Bezegh, Anal. Chem., 60, 62R (1988).
[6] J.O.Howell and R.M.Wightman, J. Phys. Chem., 88, 3915 (1984).
[7] L.Geng, A.G.Ewing, J.C.Jernigan and R.W.Murray,Anal.Chem., 54, 852 (1986).
[8] H.S.White, G.P.Kittlesen and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 106, 5375 (1984).
[9] G.P.Kittlesen, H.S.White and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 106, 7389 (1984).
[10] E.T.T.Jones, O.M.Chyan and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 109, 5526 (1987).
[11] H. Tabei, M. Morita, O. Niwa and T. Horiuchi, J. Electroanal. Chem., 334, 25 (1992).
微叉指阵列电极的制作
微叉指阵列电极的制作工序(概要)在图1中表示。
使用带氧化膜的3英寸硅基板。首先在基板表面上涂上光刻胶层，再覆盖上带图案的遮光膜，然后进行紫外线曝光，再用碱性溶液进行显影后，形成了叉指阵列电极图案（A ）。接着，将该基板放入溅射装置中，依次沉积上金属铬涂层和金属金的薄层(B)。
此外，在有机溶剂中将光刻胶层溶解，将光刻胶上覆盖的不需要的金属剥离，得到叉指阵列电极图案(C)。在该图案的整个表面用绝缘膜覆盖，在需要被绝缘膜覆盖的部分如引线部分(D)上再次形成光刻胶图案，没有被遮光覆盖的绝缘膜用干法刻蚀至电极部分露出，得到叉指阵列电极(E)。
另一方面，如果先在基板的整个表面上覆盖一层电极材料薄膜，然后通过蚀刻方法进行加工，对于那些在低温下很难制膜的具有宽还原电位窗的碳薄膜或ITO（透明电极）膜材料也可以很容易地加工成微电极。
图 1 微叉指阵列电极的制造工艺（概要）
（*出售的叉指阵列电极可能会因改良等而略有不同。）
微叉指阵列电极的特点
叉指阵列电极除了作为带状电极的集合体之外，通过将两个叉指状电极彼此的交叉排列（图3-1），其表现出在其他电极中看不到的有趣行为。即，在一个电极（G极：generator electrode ）上被氧化的氧化态物质可以在另一电极（C级：collector electrode）上被还原。
图3-1 叉指阵列电极的示意图）
图 3-2. 氧化还原循环的概念图）
叉指阵列电极的临界稳态电流可以通过求解二维扩散方程解析得到，并由下式表示:
p = 4S / (1 + S)2 （2）
S = sin (πg / 2w) / cos (π (w a --w c / 4w)) (3）
w = (w a + w c ) / 2 + g （4）
其中 K () 为第一类全椭圆积分，m, b, n, F, C*, D, w a , w c , g 分别为叉指的数量、长度、反应电子数、法拉第常数、本体溶液浓度、扩散系数、阳极，阴极的电极宽度和电极间距。当阳极和阴极的电极宽度相同且g <0.85w时，可以近似成下式[3-1] 。
参考文献
[3-1] K.Aoki, M.Morita, O.Niwa and H.Tabei, J. Electroanal. Chem., 256(2), 269 (1988).
使用IDA电极的高灵敏度伏安法
图4-1是使用叉指阵列电极测量二茂铁的循环伏安图。
图4-1 叉指阵列电极的循环伏安法测量图
在(A)中，G电极上的氧化电流从0.4V左右开始增加，C电极上的还原电流也相应增加，在0.6V左右，两者都变为绝对值大致相同的定值。
还原电流(Ic)与氧化电流(Ia)之比称为捕获率(Capture Efficiency, C. E.) ，表示在 G电极上产生的氧化态物质到达 C电极的程度。
使用微叉指阵列电极进行伏安测量，可获得90%以上的高捕获率。 另一方面，如果没有对C电极施加电位，就不会发生氧化还原循环，反应是基于正常的扩散速率，导致G电极的电流Io较小。
因此，将C电极上施加电位状态下的G电极上的氧化电流值I a的与Io的比（Ia/Io）定义为氧化还原循环数，并用作比较电流增加率的表观指标。
图 3-2. 氧化还原循环的概念图
此外，当检查具有不同扩散系数的氧化还原物质的捕获率和氧化还原循环次数时，发现两者仅由电极形状决定，而与氧化还原物质无关。
图5显示了四种可逆活性物质的氧化还原循环次数的形状依赖性。特别是当电极小型化时，氧化还原循环次数急剧增加，临界电流随着循环次数的增加而增加。这表明通过小型化提高灵敏度是有效的。
自诱导氧化还原循环
氧化还原循环是在相邻的两个电极上设置不同电位时发生的现象（一个电极是氧化电位，另一个是还原电位），通过采用特殊的电极配置，只需控制一个电极上的电位即可开始氧化还原循环。
特殊电极结构是指将大面积的导体(大电极)配置在用于控制电位的微电极附近的情况。
当微电极外围为绝缘体时，微电极产生的还原态物质仅靠浓度梯度自发扩散，以消除浓度差（图3-2）。然而，当大电极设置在微电极附近设置了大电极时，生成的还原态物质扩散到大电极，然后在大电极面向微电极的点上被氧化，同时大电极上远离微电极的点上诱发还原反应。此时，由于氧化反应产生的电子在还原反应中被消耗，所以电子在大电极内部移动，即有电流流动。
大电极两端发生逆向反应的原因是为了消除微电极产生的还原态物质的浓度梯度，但由于，大电极中的电子运动的过程远大于还原态物质的自然扩散过程，成为主导。此外，在大电极处产生的氧化态物质扩散到微电极，再次还原从而并引发氧化还原循环。
由于这种自然诱导的氧化还原循环（自诱导氧化还原循环），通过仅控制微电极的电位来放大临界电流（图 3-2）。这种自生氧化还原循环现象是通过在绝缘体中设置微圆电极的电极和薄膜分离的宏观电极中设置微圆电极的电极中获得的临界电流值进行比较来确认。
仅控制后一个微电极的电位得到的极限电流值比控制前一个电极的电位得到的极限电流值大几倍，当通过控制电位人为地诱导氧化还原循环时，后者的大电极也等于极限电流值。
更直接的确认是测量流过大电极的电流，这可以通过电流表将 IDA 的一个叉指电极连接到另一个大电极来实现。.. 表现出自诱导氧化还原循环时的电流值等于在双模式下测量 IDA 时的法拉第电流值。
此外，自诱导氧化还原循环效应可以在双电池中得到证实，其中 IDA 电极和大电极位于单独的电池中，电池通过盐桥连接（图 4-1）。
图5-1 双池体系自诱导氧化还原循环
转换溶出法
如果在容纳大电极的电化学池中的氧化还原物质被可沉淀的物质代替，也会能发生自诱导氧化还原循环。特别是，通过使用重金属离子和卤素离子，其沉淀和溶解可以通过电极的电位来控制，如下所示可以对检测电流进行转换和积分[6-1][6-2]。
在IDA电极一侧的电解池中容纳了样品溶液，而在大电极一侧的电解池中则容纳了可沉淀物质，然后控制IDA的一组梳状电极的电位对样品进行前电解（预电解）处理（图6b），由于自我诱导的氧化还原循环，在大电极上诱导了沉淀反应。 根据电荷守恒定律，该沉淀析出的量等于样品在梳状电极上发生电解的量。
换句话说，可以将样品的检测电流转化为另一种物质的沉淀电流。此外，样品的长期电解会导致大量沉淀，因为只要样品继续电解，沉淀反应就会在大电极处继续进行。换言之，检测到的电流可以随时间积分。沉积在大电极上的物质的量可以通过的溶出方法进行定量（图 6c）。
这是通过测量大电极电位扫描时获得的电流峰值来实现的。 沉淀的总量以及因此而产生的样品的总电解量可以通过峰面积进行定量。 假设在样品预电解期间有稳定的电流流动，可以从由总电解量、预电解时间和IDA几何形状确定的极限电流值来确定样品的浓度。
这种分析方法被命名为转换溶出法，因为它是将样品的检测电流转换成另一种物质的沉淀电流，沉淀物是通过普通溶出分析进行的。这种分析方法是两步电流放大法。因此，它可以对极低浓度的可逆氧化还原物质进行量化。 换句话说，它是氧化还原循环的第一次电流放大和沉积材料的时间积分的第二次放大效应。
图 6-1. 转换溶出法原理图）
(a) 自诱导氧化还原循环也能发生在双池体系中，可以观察到梳状电极和大电极之间流动的电流。
(b) 如果将右池中的氧化还原物质转换成在电极上沉淀的物质，如重金属离子，自诱导氧化还原循环仍会发展，左侧池中的反应量与右侧池中的沉淀量相等。
(c）通过控制大电极的电位，可以溶解（b）中沉积的重金属离子。 溶解量等于在左侧池中进行的反应量。
参考文献：
[6-1] T. Horiuchi, O. Niwa, M. Morita and H. Tabei , Anal. Chem.,64 (1992) 3206.
[6-2] T. Horiuchi, O. Niwa, M. Morita and H. Tabei, Denki Kagaku.,60 (1992)1130.
应用例(1)氧化态标准样品的测量
作为转换溶出法的测定例，对六胺钌的检测结果进行说明。六胺钌是以氧化态溶解的可逆氧化还原物质，适合作为转换溶出法的标准物质。
图7为测量体系的构成示意图。
对于测量池，将特氟隆烧杯与盐桥连接，盐桥使用装有饱和硝酸钾溶液且管的两端封入多孔玻璃。IDA、Ag / AgCl 参比电极和 Pt 对电极放置在左侧池中用于测量样品，玻璃碳 (GC) 电极作为大电极放置在右侧池中用于沉淀物。参比电极和对电极与恒电位仪的对应端子相连，IDA电极的两个电极端子和GC电极端子通过开关盒与恒电位仪的工作电极端子相连。
该开关盒用于预电解阶段和溶解剥离阶段之间的切换，在预电解阶段，IDA的一个工作电极（生成电极,G电极）连接到恒电位仪，另一个工作电极（收集电极, C电极）连接到大电极。在溶出剥离阶段，构成了一个电路来将大电极连接到恒电位仪。
通过将六胺钌溶解在 pH 4 的标准缓冲溶液中制备样品。用于沉淀的溶液是硝酸银溶解在硝酸钾水溶液(0.1mol/dm 3 )中。用转换溶出法检测六胺钌分以下两个步骤进行。
图7-1 转换溶出法的测量池配置
图7-2 转换溶出法的电位印加示意图
六胺钌的浓度为1µmol/dm 3。(A)是在-0.4V预电解六胺钌10分钟后获得的银离子的溶出伏安图。另一方面，(b)是在0V下进行10分钟的预电解后得到的。(C) 在无钌六胺溶液中在 -0.4 V 下预电解 10 分钟后得到的。
仅当六胺钌存在下进行电解时，才能观察到大的金属银的溶解剥离峰。在收集电极和发生电极之间插入电流表以监测在预电解阶段流动的电流，并确认在预电解开始后约30秒达到稳定状态。
由上可知，在转换溶解法中，左边电解槽中的六胺钌在发生电极上被还原，生成的还原产物在收集电极上氧化，氧化反应产生的电子用于右边银离子的沉淀池。它变得清晰了。还揭示了在收集器中产生的氧化剂形成了一个自诱导的氧化还原循环，在这个循环中它再次被发生器还原，使得在收集器和GC之间流动的电流达到了一个稳定的状态。
因此，预电解时间与银析出量成正比，说明长期预电解对低浓度检测有效。
图7-3 1 µ mol/dm3六胺钌转换溶出伏安图
(a)，含六胺钌的溶液在 -0.4 V 下预电解 10 分钟。
(b)、将含有六胺钌的溶液在 0 V 下预电解 10 分钟。
(c)不含六胺钌的溶液在-0.4V预电解10分钟。
所有电位扫描速度均为20mV/s
图7-4 10 pmol/dm3六胺钌转换溶出伏安图
(a)用含有六胺钌的溶液测量,(b)不含六胺钌的溶液测量。每个伏安图
右侧的数字是预电解时间。出现在0.3V位置的峰表示检测到六胺钌
图7-5 pmol/dm3浓度范围的校准曲线，预电解时间为10分钟。实线是计算值。
参考文献：
[7-1] J.Janata and A.Bezegh, Anal. Chem., 60, 62R (1988).
[7-2] T. Horiuchi, O. Niwa and H. Tabei, Anal. Chem., 1994, 66, 3500;
[7-3]（14) K. Aoki, M. Morita, O. Niwa and H. Tabei, J. Electroanal. Chem., 256(1988) 269.
应用例(2)还原态标准样品的测量
到目前为止，我们已经介绍了对溶解在氧化状态的氧化还原物质应用转换溶出法的例子，但是转换溶出法方法也可以应用于溶解在还原状态的可逆氧化还原物质。下面，将介绍合将水溶性二茂铁作为溶解在还原状态的标准试样，用于转换溶出法的结果。
水溶性二茂铁的转换溶出法的检测机理和方法与六胺钌相似。不同的是氧化反应和还原反应是相反的，对应的电子传递的方向也相反。如图8-1所示，在预电解阶段，在发生电极上发生氧化反应，在收集电极上发生还原反应，因此收集电极上的还原反应所需的电子必须由大电极提供。
图8-1 溶解的还原态可逆氧化还原物质的预电解机理。每个电极上的氧化和还原反应与溶解的氧化态物质时相反。
IDA电极和大电极之间的电流方向也相反。沉淀的物质是阴离子。
图8-2显示了通过转换溶出法检测水溶性二茂铁的例子。将水溶性二茂铁以1µmol/dm3的浓度溶解在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中。通过将碘化钾溶解在0.1mmol/dm3硝酸钾水溶液中至浓度为1µmol/dm3来制备沉积溶液。取决于预电解时间，观察到一个大的阴极电流峰，而在无水溶性二茂铁存在的实验中没有观察到这个峰。由此确认了通过水溶性二茂铁的电解在大电极上析出碘离子，并确认了析出的碘离子在反萃取工序中溶解的机理。
图8-2 水溶性二茂铁的转换溶出伏安图
测量值可以被拟合为一个sigmoid函数。 通过非线性最小二乘法可以确定一个有氧化还原电位意义的拟合参数为0.38V，这与水溶性二茂铁的氧化还原电位值一致。 这种测量相当于用梳状电极在双电极模式下的循环伏安法，但检测电流的极大大的放大表明，对低浓度样品进行循环伏安法测量是可能的。 然而，这种测量需要很长的测量时间，因为每获得一个点都要进行预电解。 这可以通过使用由许多对梳状电极和大电极组成的电极系统进行转换溶出来解决。
图8-3 预电解电位和溶出峰之间的关系
1µ mol/dm3的水溶性二茂铁在不同的预电解电位下被预电解5分钟。
实线是用sigmoid函数拟合的曲线。
应用例(3)微量样品分析
图9-1 预电解电位与溶出峰的关系。
通过改变预电解电位，将 1 µmol/dm3 水溶性二茂铁预电解 5 分钟。
实线拟合 sigmoid 函数。
图9-2 IDA电极上微量样品的伏安图。
参考文献
[9-1] O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall and W. R. Heineman, Anal. Chem., 65, 1559 (1993).
应用例(4)多巴胺的高灵敏选择性检测
与二茂铁等典型的可逆物质相比，多巴胺的电子传递速度慢，而且不稳定（在高pH值下）， 是一种可能由于电化学反应后的化学反应而会随时间变化的物质。因此，通过使用这种微电极，在G极产生的氧化还原物质可以在很短的时间内被C极捕获，从而有望能出现捕获和恢复不稳定中间物的显著效果。
图10-1显示了GC模式和O模式下多巴胺的CV测量值。在通常的测量方法 O 模式下，峰值波形不对称，但在 GC 模式下，观察到较大的限制电流，表明可以进行高灵敏度测量。
图 10-1. IDA电极上的多巴胺 CV测量结果
在10nM，一个数量级的低浓度下，在阳极一侧不能获得可定量化的曲线，但在阴极一侧可以进行定量的测量，尽管可以观察到由于剩余电流导致的基线斜率。 在很宽的浓度范围内观察到与氧化还原有关的极限电流，并观察到浓度和电流之间的良好线性关系（图18）。 这表明IDA电极对微量成分的定量检测是有效的。
图10-2 低浓度多巴胺的伏安图
图 10-3 多巴胺极限电流的浓度依赖性图。
另一方面，较小尺寸的电极（3µm 电极宽度，2µm 间隙），如图10-4右侧所示，即使在混合体系中也能观察到多巴胺的极限电流，这表明多巴胺的氧化物种在变化之前就在还原电极上被检测到（d）。 这种选择性明确地取决于电极的几何形状，并有望随着电极的变小而得到改善。 由于IDA电极本身的选择性和聚合物膜的改性，可以预期进一步的选择性检测。
图10-4多巴胺和抗坏血酸的伏安图。
测量是通过在梳状电极的C电极上施加多巴胺的还原电位和在G电极上从0V到多巴胺的氧化电位进行的。 在样品中没有抗坏血酸的情况下，C电极上的电流在电位步骤后立即达到稳定状态，表明氧化的多巴胺在膜上迅速扩散。 另一方面，当电极被Nafion单层修饰时，由于多巴胺在膜中的低扩散率，快速反应没有实现，电流的绝对值下降。
其次，在含有过量抗坏血酸的样品中，C电极上的电流一开始很低，但几秒钟后就增加了，并与不含抗坏血酸的样品中得到的数值几乎相同。 在施加电位后，由于下层薄膜中存在L-抗坏血酸，大部分在G极氧化的多巴胺在到达C极之前就被还原了，而L-抗坏血酸的选择性很低。 然而，由于Nafion膜的原因，抗坏血酸每次只能从溶液中提供一点进入膜，所以膜中的浓度迅速下降。
图 10-5 用亲水/聚酯离聚物双层膜修饰的梳状电极上的多巴胺选择性
多巴胺：10 µM，L-抗坏血酸，a：0 µM，b：200 µM，c：600 µM，d：1000 µM
[10-1] O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall and W. R. Heineman, Anal. Chem., 65, 1559 (1993).
应用于高效液相色谱的检测器
高效液相色谱的电化学检测 (HPLC-EC) 与发光和荧光检测一起被认为是高灵敏的检测方法。在流动体系中使用叉指阵列IDA电极进行电化学测量的效果不如在静态体系中的测量，因为流动减少了氧化还原循环的次数。但是，近年来，生物样品等的测定使用 1 mm 以下的极小色谱柱，在这种情况下，使用叉指阵列IDA电极作为检测器是有效的，因为与传统电极相比，它使用了非常小的流速。
图 11. 标准尺寸微孔柱与IDA电极检测器组合得到的多巴胺校准曲线 ○：3mm 直径柱 □：1mm 直径微孔柱
传统上，金和铂等金属已被用于此类薄膜微电极探测器。 尽管金属适合于微细加工，但它们有一些问题，如在用于色谱检测器时，由于其对氢和氧的还原过电压较低，所以在还原方面的检测灵敏度较低。
最近，因为建立了有机化合物的热CVD方法及其微细加工工艺，并能够制造出微米级图案的碳梳状电极。
在色谱检测器中使用IDA电极可以获得多巴胺 100 pM（绝对量小于 1 fmol）的低检测限。